植物内生菌论文

植物内生细菌的应用研究进展

摘要:近年来植物内生细菌受到越来越多的关注。对植物内生细菌分离研究的历史作了简要的介绍,并概述了内生细菌的多样性及其应用,提出了植物内生细菌的研究中可能出现的问题,展望了其应用前景。

关键词:植物内生细菌;应用;分离;多样性;生物防治

1 植物内生菌的发现过程和定义

植物体内普遍存在着内生菌，由于其生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，因此植物内生菌的存在和作用长期以来未被发现。直到20世纪30年代，由于牲畜食了感染内生真菌的牧草，给畜牧业造成重大损失，才开始对植物内生菌有了初步认识。内生菌一词“endophyte”最早是由德国科学家DeBarry于1886年提出。1986年，Carrol将植物内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内不引起明显症状的微生物。1991年，Petrini提出植物内生菌是指生活史的一定阶段生活在活体植物组织内不引起植物明显病害的微生物。1992年，K1eopper等认为植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物，并首次提出了“植物理内生细菌”的概念，他认为能在植物体内定殖的致病菌和菌根菌不属于内生菌。

目前，植物内生菌较被公认的定义是指那些在其生活史的一定阶段或者全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或者细菌，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在症状，是一个生态学概念，而非分类学单位。 植物内生细菌是从表面消毒的植物组织中分离而得到或从植物内部获得的,但它们的存在并未使植物的表型特征和功能发生改变。长期以来,主要通过化学农药防治植物病害,这种方法虽然能够较快地防治疾病,但是与此同时,也引起了植物病原抗药性、农药残留等问题,造成了严重的环境污染和生态破坏。植物内生细菌几乎存在于所有健康植物体内,与植物和谐共处,不仅能够避免使用化学农药给人类健康和环境带来的隐患,还能避免使用杀菌剂在杀死病原菌的同时杀死在环境中起重要作用的非靶微生物和使用其他生物菌肥破坏植物根际土壤的微生态平衡,在防治植物病害上有很大的应用潜力。因此,植物内生细菌作为生物防治菌株,发展迅速,成为当前微生物学领域研究的热点[1]。

植物内生细菌的应用,首先要筛选出植物内生细菌拮抗菌株。目前已经筛选出了许多具有拮抗作用的内生细菌菌株,其中以土壤根际细菌居多,主要有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞杆菌(Pseudomonas)、短小杆菌(Curtobacterium)、肠杆菌(Enterbacter)、欧文氏菌属(Erwinia)等。 2内生细菌的分离研究

1876年,Pasteur从无菌葡萄果汁中分离出植物内生细菌,从此内生细菌的研究备受关注。植物内生细菌可存在于植物的根、茎及花、果实和种子中,1951年HOLLISJP从马铃薯块茎中分离到节杆菌属(Arthrobacterureafaciens)、巨大芽孢杆

菌(Bacillus megaterium)、阴沟气杆菌(Aerobac-tercloacae)。1963年SAMISHZ等在番茄和黄瓜的果实中分离出多种内生细菌,包括阴沟气杆菌(Aerobactercloacae)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、黄杆菌(Flavobacterium sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、黄单胞菌(Xanthomonas sp.)、棒杆菌(Corynebacterium sp.)。1990年MISAGHIIJ等在棉花的根、茎、胚根、花、种子中发现有内生细菌,并且棉花无表现症状。1995年,URATANIBB等从玉米的根、茎中分离出内生细菌木质棍状杆菌犬齿亚种(Clavibacterxyli subsp.cynodontis)。同年,PLEBANS等在温室中对向日葵的花和花椰菜的种子中接种内生细菌对病害进行防控。随着对植物内生细菌研究的深入,在越来越多的植物中发现存在内生细菌。 3 植物内生菌的研究现状

3.1 植物内生菌的生物多样性 植物内生菌的生物多样性主要包括寄主植物种类多样性、内生菌在寄主植物不同部位分布多样性和内生菌自身种类多样性。研究发现植物内生菌广泛存在，地球上300000种植物中都有内生菌的存在。农业上对内生菌研究较多的植物有水稻、小麦、棉花、高粱、牧草、马铃薯、玉米、甘蔗、甜菜、黄瓜、柠檬等。研究发现植物内生菌几乎存在于植物的所有组织中，不仅存在于植物的根、茎、叶、花、果、胚、种子中，在植物的根瘤中也分离到了内生菌。

植物内生菌的种类也十分繁多，主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌三大类。目前已报道在各种农作物及经济作物中发现的植物内生细菌已超过129种，分属于54个属，主要为假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、甲基杆菌属(Methylobacterium)等。植物内生真菌主要在药用植物、羊茅属植物、热带树木中研究较多，现在发现的内生真菌主要为子囊菌类(As comycet)及其无性型，包括核菌纲(Pyrenomyetes)、盘菌纲(Discomyetes）和腔菌纲(Loculoascomyetes)等。植物内生放线菌主要在红树林、热带多年生树木及一些药用作物中研究较多，主要为链霉菌属(Streptomyces)、链轮丝菌属(Streptoverticillum)、游动放线菌属(Antinoplanes)、诺氏卡菌属(Nocardia)、小单胞菌属(Micromono sp.ora)。Rodrigo Mendes等在巴西田地甘蔗的根和茎中分离出了内生细菌,并发现根中的内生细菌密度很高。Cottyn等发现水稻种子中 4%的内生细菌对稻纹枯病菌和稻瘟病菌有拮抗作用。植物内生细菌作为植物微生态系统中的天然组成成分,其存在对加强植物对环境的适应性具有重要意义。植物内生细菌长期生活在植物体内并与植物协同进化,一方面植物体为其提供生长必需的能量和营养;另一方面,内生细菌又可通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响[2]。

3.2 植物内生菌的动力学研究

植物内生菌的动力学主要指内生菌在植物体内的定殖、分布和运动。内生菌一旦进入植物体内就寻找适合自已生存的组织定殖下来，而不是在各组织间到处扩散。Posada和Vega认为植物内生细菌主要定殖在细胞间隙。刘忠梅等采用链

霉素和利福平抗性标记B946菌株发现B946向茎基部和叶内转移。植物内生菌可以定殖于植物的根毛、叶片、维管组织、木质部的表皮细胞、细胞间隙、细胞质中等。内生菌可以很容易地穿过植物皮层进入木质部导管中，随着植物的生长可以将内生菌运送到植物上部营养器官或繁殖器官中。而有些内生菌定殖在植物种子内，成为“种生内生菌”，成为下一代植物新植株内生菌的重要来源。

内生菌在植株内的分布与寄主植物和部位有相关性。植株不同，其体内内生菌群落结构有差异。马冠华等分离了烟草、甜玉米、棉花和水稻4种植物根、茎、叶的内生细菌发现，烟草根、茎、叶中的内生细菌菌量趋势与甜玉米和棉花相同，根最多，茎次之，叶最少；而与水稻的根最多，叶次之，茎最少的趋势不同。Rosenblueth和Martines研究认为内生菌在植株体内的分布通常下部组织多于上部组织，越往植株顶部，内生菌越少。植株中内生菌群落结构组成不仅与植株类型、植物器官、生长环境、生育期有关，还与品种有关。高增贵等研究发现内生细菌在不同玉米品种和不同生育期存在程度不同，品种的遗传背景与其内生细菌的种类和数量显著相关。Conn和Franco发现土壤类型对小麦内生菌的种群结构组成起决定作用。植物内生菌具有一定的运动性，运动不仅有利于定殖作用，而且可以使内生菌及时避开来自于外环境的生存压力。蔡学清等研究了辣椒内生细菌BS-1和BS-2在辣椒、白菜体内的定殖动态，发现BS-l和BS-2在辣椒体内通过维管束(木质部)进行传导。Compant等发现内生菌Burkholderia在葡萄Vitis vinifera地上部分是通过蒸腾系统进行系统性传播。安千里等用共聚焦激光扫描显微镜观测GFP标记的内生固氮菌Klebsiella oxytoca SA2侵染水稻根时，发现SA2主要从侧根皮层进入内皮层和维管束。

4植物内生细菌的应用

植物内生细菌分布于植物的不同组织中,不仅受到植物组织的保护而不受外界恶劣环境(如强烈日光、紫外线、风雨等)的影响,而且有充足的营养物质,因此具有稳定的生态环境,占据有利于生防的生态位,相对于腐生细菌更易于发挥生防作用[3]。张颖等[4]通过从小麦中分离出内生细菌,从中筛选出对小麦全蚀病菌具有拮抗作用的菌株,该拮抗菌可以在一定时间内定殖于植物根系,弥补了利用土壤拮抗微生物对其进行生物防治而受土壤中其他微生物的竞争作用所造成的不足。Hu X等筛选出来抗半夏软腐病的内生拮抗菌,提出利用无病原种苗预先接种拮抗菌的是植物半夏抗软腐病的一个策略。

4.1构建植物内生细菌抗病或杀虫工程菌

以植物内生细菌为载体,构建植物内生细菌抗病或杀虫工程菌,利用内生细菌将某些抗病或杀虫基因导入植物体内,提高植物的抗病虫能力而不改变植物本身的基因,保持植物的天然性状。Andrews首次将Bt基因构建于内生细菌木质棍状杆菌犬齿亚种(Clavibacter. xyli subsp. cyndontis)中防治玉米螟害虫;Yan Nian-Long等将有带有vip3A 基因的有杀虫活性的细菌苏云金杆菌和内生细菌枯草芽孢杆菌(B.subtilis)融合构建多功能工程菌,兼有杀虫活性和内生菌的特性,对

黄瓜枯萎病病原(F.oxysporum f.sp.cucumeri-num)具有拮抗活性。要注意的是,构建植物内生细菌抗病或杀虫工程菌时,必须考虑内生细菌本身对寄主植物的作用效果,若以对植物生长有促进作用的内生细菌为载体,构建杀虫或防病工程菌可能更有应用价值[5]。ZINNIEL D K等从美国中西部的玉米和高粱上分离得到内生细菌Microb-acterium testaceu并验证了其菌株IFO12675、SE034、CE648中质粒的转换能力,将从内生细菌中分离出来的质粒pBUN349转入大肠杆菌中,pBUN349表达出FFlux报告基因,他指出内生细菌可作为成为基因工程菌转移到其他植物中,从而达到抗病的目的。

4.2 在医药上的应用

研究表明植物内生菌代谢产物有抗肿瘤、抗菌，抗病毒等作用。Gary和Strobel等从欧洲红豆杉中分离到内生真菌Acremzonium sp.能产生一系列抗真菌、抗癌的肽类活性物质，其中白灰制菌素(leucinostatin)能很好地抑制人类的一些肿瘤细胞。Strobel研究小组从卫矛科著名药用植物雷公藤中分离到的内生真菌Cryposporiopsis cf.quercina，能产生一种新型环肽抗生素cryptocandin，对癣菌及白色念珠菌等人类病原真菌具有强烈抑杀作用，其MIC与临床应用的抗真菌药两性霉素B(amphotericin B)相当，具良好开发前景。Castillo等发现K.nzgriscans的一株内生链霉菌能够产生一类活性多肽Munumbicicins，这类多肽不仅具有广谱的抗菌活性，而且对有耐药性的病原菌、寄生虫有很好的抑制作用。利用植物内生菌的次生代谢物质开发新的药物将是今后医药方面的研究方向之一。

4.2 作为外源基因载体

由于内生菌在植物体内的适应性，一些研究者以内生菌为受体构建植物内生防病或杀虫工程菌，再将其引入植物体内，使植物起到与转基因防病杀虫植物相同或类似的作用，从而达到生物防治的目的。2000年Dowring等在从苹果苗中分离出内生菌Pseudomonesa fluorescens中转入抗病chiA基因，再把这种携带的chiA基因的内生菌接种到豆苗中，可以防治豆苗病原真菌Rhizoctomia solani，同时还在甘蔗内生菌中转入抗虫基因cry 1AC7基因，回接甘蔗，可以防治甘蔗钻心虫Eldana saccharina。美国CGI公司以内生细菌－ 木质棒形杆菌犬齿亚种(Clavibacter xyli subsp.cyndontis)为载体，将BT杀虫基因整合到染色体上构建杀虫工程细菌，这种杀虫工程菌从1988年开始已在美国4个州12个玉米杂交品种上进行大田试验，可使虫害损失率减轻26%～72%。

4.3用于毒性有机化合物的生物降解

许多内生细菌能够降解环境污染物,国外已有许多成功的报道。Van Aken等描述从杂交杨树(Populusdeltoi-des X Populusnigra DN34)中分离的甲醇内生细菌Methylo-bacterium populi BJ001能够降解TNT、RDX和HMX,在2个月内使RDX和HMX减少60%,有望修复含有硝基芳烃化合物的土壤。从比利时BTEX污染区的杂交杨树(P. tricho-carpa X P. deltoides cv. HazendensHoogvorst)中分离的内生细菌菌株能够降解VOCs和被氯消过毒的有机除草剂(2,4-D)。Porteus Moore等描述从杂交杨树中分离出121个内生菌株并已辨认出其中有34株有植物修复的潜能。Germaine等报道当豌豆(Pisum sativum)植株中接种从杂交杨树(P. trichocarpa X P. deltoides cv. Hoogvorst)中分离的假单孢内生菌Pseudomonas putida VM1450 时,植株中既没有2,4-D积累也无任何药害迹象,分离出的内生细

菌菌Pseudomonas putida VM1441(pNAH7)能够降解萘,这表明这些内生细菌有应用于2,4-D和萘污染的土壤的生物修复的潜能。植物内生细菌应用于生物降解有许多有益之处,细菌分解污染物的基因的数量能够决定其降解效率,细菌的分解途径比植物分解途径更容易,而且能够分解植物中的毒性污染物以减少对土壤的毒性作用;最大的优点是应用能够植物内生细菌能够避免因根际细菌之间的竞争而导致降解菌株减少。但是,其不足之处在于,这种方法比传统修复技术稍慢,植物的选择受季节性控制,而且如果污染物降解不完全就会随着植物被人食用进入食物链。

国内有报道植物内生细菌作为降解化学农药的菌株解决农产品中农药残留问题,但目前发现的能用于降解化学农药的内生细菌并不多。曹喆等[6]从植物龙葵中分离出来能够去除Cd2+的内生细菌,有望利用内生细菌解决重金属污染问题。李雪梅等[7]从香荚兰气生根中分离到1株产香内生芽孢杆菌 Van-1a,经培养转化生成了含有香兰素及愈创木酚衍生香味物的天然香料。该天然香料能与烟香较好谐调,具有提调烟香、细腻醇和烟气、改善卷烟吸味的良好效果。 5存在的问题

在植物内生菌生物学特性研究上，由于内生菌生活在植物这一特定的生境内，植物不同、环境不同，其生活的环境和营养条件也不同，现在没有一种理想的培养方法可以检测到所有的植物内生菌，寻找一种切实可行的植物内生菌检测方法对于植物内生菌生物学和生态学研究尤为重要。

而对于植物内生菌群落多样性研究，由于研究条件和技术方法的限制，目前研究甚少，结论都不是很全面，但是DGGE等微生物免培养研究方法在植物内生菌多样性研究中的成功运用，开辟了植物内生菌多样性研究新思路。通过借鉴土壤微生物多样性研究思路与方法，如DGGE、磷脂脂肪酸法(PLFAs)等，来分析植物内生菌群落结构多样性，将是未来内生菌多样性研究的新方法。

植物内生菌具有拮抗性和致病性双重特性，因此在内生菌开发应用方面，除了开展内生菌在病虫害防治方面的开发和应用外，还要考虑其病理学上的特性。同时植物内生菌本身是一个生物活体，田间环境和植物体微生态环境中的许多因子都会影响内生菌防病功能的发挥，因此在利用植物内生菌进行大田防病时，必须考虑其生态学、病理学和形态学等方面的影响。

植物内生细菌带来益处的同时,也出现了许多问题。

研究发现,内生细菌的污染比一般的细菌污染更为严重,往往会造成严重的损失。应通过对这类内生细菌污染源的鉴别,来控制污染。此外,在生物防治中要考虑内生细菌与植物或其他微生物建立共生关系或拮抗关系。另外,内生细菌在农业防病中的应用还有欠缺,目前对于农业病害大多采用农药,采用内生细菌在实际防治农业病虫害中并未推广,而且推广起来也是困难重重,如植物内生细菌的大量分离、存放问题以及农民的认可。真正用于实际中还是存在很多问题需要加强研究。所以应采用植物检疫、建立无病留种田、进行种苗消毒和注意田间卫生以减少菌源；利用抗病品种、采取轮作、高垄种植等防病栽培措施,防治介体昆虫;利用细菌噬菌体作种子带菌检验，以及加强田间病害流行的预测等 6展望

植物内生细菌防治范围广,对细菌病害、真菌病害、病毒病害和线虫病害都有一定的作用,开发应用其资源菌不仅能解决农药带来的诸多问题,减少农药和化

肥的使用量,还能保持农田微生态系统多样性,维持农田生态平衡,提高作物产量,实现农业的可持续发展。因此,植物内生细菌的发展前景非常广阔,利用植物内生细菌进行生物防治是一项经济、有效、可持续的绿色无污染的技术。

7参考文献

[1] 郝荣乔.植物内生均成为我国当前微生物研究领域的热点[J].微生物学通报,2009,36(1):1.

[2] 胡萌.植物内生细菌研究进展[J].山东农业大学学报:自然科学版,2008,39(1):148-151.

[3] 冉国华,张志元.植物内生细菌研究及其应用[J].海南大学学报:自然科学版,2004,22(4):366-370.

[4] 张颖,王刚,郭建伟,等.利用小麦内生细菌防治小麦全蚀病的初步研究[J]. 植物病理学报,2007,37(1):105-108.

[5] 何红,邱思鑫,胡方平,等.植物内生细菌生物学作用研究进展[J].微生物学杂志,2004,24(3):40-45.

[6] 曹喆,罗胜联,曾光明,等.一株龙葵内生细菌SDE06 去除Cd2+的实验[J]. 微生物学通报,2009,36(3):328-333.

[7] 李雪梅,徐若飞,杨黎华.利用香荚兰内生茵制备天然香料及其在卷烟中的应用. 烟草科技,2008,(3):31-34.